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分光光度计原理及分类介绍
发布时间:2011-03-03   点击次数:1753次

一、分光光度计的一般原理:
分光光度计是利用分光光度法,通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析。
不同种类的分光光度计的基本原理相似,都是利用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源。光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,通过测量样品的吸光值,经过计算可以转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

二、分光光度计类型,及应用领域:
分光光度计有哪几种不同的分类方式:
1.分光光度计按照波长及应用领域的不同可以分为:
(1)可见光分光光度计:测定波长范围为400~760 nm的可见光区;
(2)紫外分光光度计:测定波长范围为200~400nm的紫外光区;
(3)红外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区;
(4)荧光分光光度计:用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱;
(5)原子吸收分光光度计:光源发出被测的特征光谱辐射,被经过原子化器后的样品蒸气中的待测元素基态原子所吸收,通过测定特征辐射被吸收的大小,来求出被测元素的含量。
2.分光光度计按自动化程度分类:可分为手动、半自动、自动分光光度计。
3.分光光度计按软件可分为:带扫描、不带扫描。

三、分光光度计zui常见的用途和常用波长:
1.核酸的定量
核酸的zui高吸收峰的吸收波长260 nm。利用260nm的波长可以定量测量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA的浓度。
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度。如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。
2.蛋白质的直接定量
这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg 公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。
3.细菌细胞密度
细菌培养过程中,需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。
OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。在600nm波长下,以未加菌液的培养液作为空白液,测量定量培养后的含菌培养液。 

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