我们这里讨论琅伯-比尔定律的限制性条件。其一：通过溶液的光必须是平行的；其二：通过溶液的光必须是单色光；其三：待测溶液必须是纯净的、均匀的且浓度不宜过高，这是琅伯-比尔定律首要的三个前提条件。但是在实际的分光光度计的制造和使用过程中这三个条件是不可能达到的。其一：因为光是直线传播的，在分光光度计制造过程中，灯源发出的光是发散的，经过聚焦镜进行聚焦等直到经过溶液的整体过程中，光是不可能平行的。其二：灯源发出的光是复合光，经过狭缝，再经过光栅分光等步骤，因为受到狭缝和光栅本身的限制，光栅分光不可能达到纯单色光。还有光度计的整体设计问题，光度计不可能没有其它的杂光存在。其三：用户的溶液也不可能是纯净的，也会含有一些杂质，这些对光度的吸收都会存在影响。除以上三个方面的影响外，在实际的光度计应用过程中还会存在其他因素的影响，例如：1、经过比色皿的光是否垂直；2、比色皿宽度是否为10mm的标准值；3、测试波长是否准确；4、程序设计是否存在漏洞等等，都会直接影响到利用琅伯-比尔定律计算出的结果。
所以在日常的测试过程中，得出的结果和琅伯-比尔定律有些偏差是很正常的，只是我们关注偏差多少的问题。
二、分光光度计使用的外部环境要求
分光光度计属于精密仪器，应当妥善保管和精心维护，这样才能保证分光光度计长期使用、长期的稳定可靠、测量精度高。元析公司在多年的生产和应用的过程中，得到了一套在一定环境下维护分光光度计的经验，具体如下：
1、环境温度在条件容许的情况下，尽量保持在15-30摄氏度之间，这样能保持电器件稳定工作，不易老化，使分光光度计不易损坏，灯源的使用寿命得到延长。若条件不容许，在高温的情况下，缩短开机时间，使用分光光度计，使电器件不要长期保持在高温下。在低温下，使预热时间比常温下的预热时间要长，这样能保证在仪器稳定的情况下进行测试。
2、环境湿度在条件容许的情况下，尽量保持在60%以下，这样能保证光度计内部的光学件和电器件不易受潮、腐蚀、和上霉。若条件不容许，在高湿度和低湿度的情况尽量保持通风。
3、环境在条件容许的情况下尽量保持洁净，打扫环境时动作不宜太大，不要扬起灰尘，打扫之前用防尘罩盖上分光光度计，不要让灰尘进入分光光度计内部。
以上仅就仪器使用的外部环境作了描述，以供使用用户参考。
三、吸光光度法及722 型分光光度计的使用
吸光光度法
基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。
（一） 光线：
光线的波长： 200nm-400nm 紫外线*
400-750nm可见光*>750nm 红外线
光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。
（二） 物质的吸收光谱及颜色：
1． 物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的zui外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为
激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发射光谱。不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在吸收峰。
2． 可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的
光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。（如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光（600nm）而成蓝色）不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。
（三） 光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：
一束平行单色光（Io）通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,还有一部分被器皿表面反射（Ir）,则：
Io=It+Ia+Ir 。那么，该溶液透光率为: T = It / Io 。
1． Lambert 定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:
A=Ig（Io/It）=Ig（1/T）=k2b
k2 为吸光系数，为常数。与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A 为吸光度（又称光密度
O.D 或消光度E），当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时，A 与b 成正比。
2． Beer 定律：设有一束平行单色光,通过浓度为c 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:
A=Ig（Io/It）=Ig（1/T）=k4c
k2 为常数。由Beer 定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时，A 与c 成正比。
3． Lambert-Beer 定律：综合1.2.得： A=Kbc ,
即：当入射光波长、吸光溶液的性质和温度一定时，A 与b、c 成正比。
（四） 吸光光度法的基本原理：
1、 不同物质，由于其分子结构和原子组成不同，故对光的吸收光谱不同（如：CuSO4），在测定不同颜
色的物质浓度时要用zui大吸收的波长的入射光，这样测量的灵敏度zui高。
2、 同一种物质，若浓度不同，则对同一波长的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比关系。
3、
应此，利用特定波长的单色光（通常用zui大吸收波长的入射光）照射不同浓度的某一溶液时，所得的吸光度大小应与溶液浓度呈线性关系，故可利用该线性关系通过计算或查标准曲线来求得未知溶液的浓度。
（五） 吸光光度法特点：
1． 灵敏度高：mg%级、甚至ug%级。
2． 准确度高：误差2-5%
3． 操作简便、快速，仪器设备不复杂，价格低廉，故应用广泛。
分光光度计的使用：
（一） 分光光度计的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱镜或光栅等分光器获得纯度较高的单色光
来测量未知溶液的浓度的方法。
（二） 常用分光光度计：可见光、紫外、红外分光光度计，
荧光分光光度计，火焰分光光度计等。
（三） 722 型分光光度计的结构（略）
（四） 分光光度计的操作步骤
1）预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。
2）选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。
3）固定灵敏度档。根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸光度读数为0.2-0.7，选择合适的灵敏度。为此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1”档。
4）调节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。
5）调节T=100％。将盛蒸馏水（或空白溶液或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的*格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器，使透光度T=100％，即表头指针恰好指在T=100％处。
6）测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。
7）关机。实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
注意事项：
1）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。
2）比色皿的使用方法：
①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
②清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1∶2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。
每次做完实验时，应立即洗净比色皿。
③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。
④测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。
⑤在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。
四、分光光度计的性能检查
（1）波长校正：使用光电比色计或分光光度计，在更换光源灯、重新安装、搬运或检修后，以及仪器工作不正常时，都要进行波长校正。就是正常工作的仪器，每隔一个月也要检查一次波长，必要时进行校正，这样才能保证波长读数与通过样品的波长符合，保证仪器的zui大灵敏度。方法常用谱钕滤光片校正法，适用于721型仪可见光区的波长校正，常以585nm或529nm处的吸收峰或T%为标准。鉴于721型仪器的出射光波长较宽，不易将573nm和585nm的两峰或两谷分开，校正时易产生误差，故推荐用529nm处的峰或谷为标准来进行波长校正。校正时，将仪器按要求预热。要求电源电压稳定。波长度盘置580nm处，T%调至zui大，在比色杯处放一白纸条，观察是否有光强均匀、边缘无光晕或杂光的光斑，如不符合要求，可调节灯泡位置使其符合要求，是为波长校正的粗调。再把灵敏度扭置于“1”（zui低档），波长度盘对准529nm，电表机械零点为零，在光路空白时调T%为100%T，并反复查零点和100%T稳定情况。将谱钕滤光片插入光路，慢慢旋转波长度盘，找到透光率zui低的一点（向左右微旋波长度盘时，该点透光率值均增加），这一点即为波长529nm。检查波长度盘的指示值是不是529nm，如指示值为534nm，此时波长工误差为5nm，超出规定（±1nm）必须进行调整。下一篇：721分光光度计的使用方法
